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ELISA實驗操作注意事項及常見問題解答

一、ELISA操作前準備工作

試劑盒的選擇

ELISA操作前,應做好實驗的設計、選擇適合自己檢測范圍和靈敏度的試劑盒、提前訂購和準備試劑及耗材、處理樣本等準備工作。

樣本處理

在收集標本前需有一個完整的計劃,需要清楚要檢測的成份是否足夠穩定。ELISA檢測提倡新鮮標本盡早檢測,對收集后當天就進行檢測的標本,及時儲存在4℃備用,如有特殊原因需要周期收集標本,請取材后,將標本及時分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因冰室與室溫存在一定溫差,蛋白極易降解,直接影響實驗質量,所以避免反復凍融。

二、ELISA標準品溶解

標準品是試劑盒的檢測抗原的一個度量標尺,因此標準品的溶解、倍比稀釋和保存要特別注意以下細節:凍干標準品溶解按照說明書的要求,準確復溶。在冰上操作標準品為佳,靜止5-10分鐘,輕輕搖勻后按照一次量分裝,在-20度或-70度保存。標準品嚴禁反復凍融。標準品的倍比稀釋應事先做好準備,如離心管的準備和編號以及稀釋液的準備;稀釋時,應充分混勻;采用進口或者硅化的EP管,減少蛋白吸附。在實驗孔內進行倍比稀釋時,注意操作規范,槍頭勿刮劃預包被的孔底。

三、ELISA操作中的洗滌

洗滌是ELISA實驗中是最多次數的操作,也是非常重要的步驟。不嚴格的洗滌容易出現洗不干凈或交叉污染現象,實驗重復效果差的現象。不管用多道加樣器、洗瓶、吸管,還是洗板機,嚴格按照說明書操作不要減少步驟洗滌的洗滌體積、洗滌時間和洗滌次數。注意標準化操作將減少實驗誤差和不同實驗之間的誤差。操作者常出現洗板不干凈現象,請比照“手工洗板小貼士”操作:

a)洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定會增高。

b)特別注意:設計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,保證甩掉洗液時,空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側或分開最好。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(從正上方旋轉120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。

c)用干凈的濾紙,不要用衛生紙,因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導致洗板不干凈,結果偏高或偏低,重復孔的數值也會相差很大。

d)每次拍板不要重復在一個地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不干凈,拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下,最后一次一定要扣干凈。

e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數。洗板時間太短,洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數可以使背景更干凈。

四、ELISA的標準曲線如何擬合?

一般情況按照說明書推薦方法擬合標準曲線。標準曲線可以由酶標儀附帶軟件自動生成,也可手動制作。標準曲線呈“S”形曲線,兩端趨于水平,中間趨于線性,中間部分為較佳的檢測范圍。當標準品的量超過與包被抗體結合的量,此時標準品已飽和,再增加標準品的量,其OD值不再變化,故當標準品達到一定濃度后,曲線就趨于水平。一般廠商給出的濃度范圍落在中間線性范圍,根據標準曲線,可以測出樣本的濃度。按照科學分析方法,如果存在“奇異點”或者“污點”,直接采用線性分析不是很好,要對擬合標準曲線的幾個點進行取舍,同時也可改用雙對數直線擬合或者四因素曲線擬合。

五、常見問題

1、ELISA試驗出現非常弱的結果,常見有7種原因,其解決方法如下:

1)可能原因:溫育的時間或者溫度不夠;

解決方法:校正溫育箱溫度。

2)可能原因:顯色反應時間太短;

解決方法:校正定時鐘準確定時。

3)可能原因:所用配制緩沖液的蒸餾水有問題;

解決方法:使用新鮮合格的蒸餾水。

4)可能原因:加入抗體/酶的稀釋液濃度太低;

解決方法:按照說明書保存試劑盒和準確配制工作液。校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密。

5)可能原因:酶標儀濾光片不正確;

解決方法:檢查酶標儀使用的濾光片。

6)可能原因:試劑盒沒有充分平衡;

解決方法:試劑室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫。

7)可能原因:不正確的試劑儲存方式;

解決方法:按照說明書要求保存試劑盒。

2、試驗的標準曲線和測定的重復性差,這是什么原因造成的?

答:試驗的標準曲線和測定的重復性差,這是典型的由測定操作引起的問題,常見原因如下:

a)可能原因:加樣本及試劑量不準;孔間不一致;

解決方法:校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密。

重復某一樣品時,加樣時間盡可能與第一次接近;

重復測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;

樣品稀釋前應充分混勻。

b)可能原因:加樣過快,孔間發生污染;

解決方法:重復測定標本,操作條件、人員等應盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

c)可能原因:加錯樣本;

解決方法:檢查記錄和試劑,是否加錯樣本。

d)可能原因:加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區;

解決方法:加樣槍頭不要貼壁。

e)可能原因:不同批號試劑盒中組分混用;

解決方法:不同批號試劑盒中組分不可混用。

f)可能原因:溫育時間、洗板、顯色時間不一致;

解決方法:檢查時間是否一致。

g)可能原因:孔內污染雜物;

解決方法:離心樣品,排除雜物。

h)可能原因:試劑/樣品沒有混勻;

解決方法:充分混勻樣品和試劑。

i)可能原因:血清標本未完全凝固即加入,反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血

細胞,易出現假陽性反應等。

解決方法:待血清標本完全凝固后做試驗。

3、 試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,應如何分析和查找原因?

答:試驗結果白板,而且陽性對照不顯色,常見原因如下:

a)可能原因:漏加或者誤加試劑;

解決方法:檢查試驗記錄和剩余試劑。每次加液前均應核對標簽。

b)可能原因:試劑過期;

解決方法:使用有效期內的產品。

c)可能原因:洗板液配制中出現問題,如量筒不干凈含HRP酶抑制物(疊氮鈉

等);

解決方法:使用干凈的器皿,正確配制試劑。

d)可能原因:溫育的時間或溫度不夠;

解決方法:校正溫育箱溫度。

e)可能原因:標準品失活或者丟失;

解決方法:標準品正確保存、溶解和混勻。

f)可能原因:抗體失活或者丟失;

解決方法:更換抗體或者提高抗體濃度

g)可能原因:酶失活或者丟失

檢查方法:把工作濃度的酶再稀釋20-100倍,取5uL加入50ul的顯色底物,終止后顯色是否能達到1.0左右,此為酶的粗略估計。

解決方法:更換酶或者提高酶的濃度。

h)可能原因:顯色底物失活

檢查方法:加少量的工作濃度的酶,TMB是否很快顯色。

解決辦法:更換顯色底物.

4. 試驗結果空白背景高,這是什么原因造成的?

答:試驗結果空白背景高,常見原因如下:

a)可能原因:洗板不干凈;

解決方法:充分洗滌,徹底拍干;洗板要防止交叉污染;濃縮洗液準確配制;吸嘴盡可能一次性使用;加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用,不要反復使用,否則易造成污染。

b)可能原因:顯色液變質或者試劑過期;

解決方法:檢查試劑盒有效期。

c)可能原因:試劑稀釋有誤,如加酶的濃度過高;

解決方法:請按說明書所示稀釋倍數配制;

d)可能原因:蒸餾水受酶等污染;

解決方法:使用新鮮蒸餾水;

e)可能原因:試劑混用;

解決方法:不同批號試劑勿混用。

f)可能原因:培養箱溫度超過37℃或反應時間過長。

解決方法:顯色反應時間適當縮短。

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